應(yīng)用案例

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，由于早期臨床癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)常常是中晚期。自噬是一種進(jìn)化保守的正常細(xì)胞中監(jiān)視機(jī)制，它通過(guò)清除分解受損的細(xì)胞器和聚集的蛋白質(zhì)，并將產(chǎn)生的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重新利用。在結(jié)直腸癌中，自噬對(duì)腫瘤的促進(jìn)與抑制雙重作用廣泛得到認(rèn)可，因此，明確自噬對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的作用，將為結(jié)直腸癌的治療提供更多的理論依據(jù)。

2020.10.6 南方醫(yī)科深圳醫(yī)院病理學(xué)系李祖國(guó)教授研究團(tuán)隊(duì)在Cell Death & Differentiation (IF15.828）雜志上發(fā)表研究論文《MYH9-dependent polarization of ATG9B promotes colorectal cancer metastasis by accelerating focal adhesion assembly》。研究了ATG9B蛋白在結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)轉(zhuǎn)移中的作用，及尋找CRC轉(zhuǎn)移的潛在診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)免疫組化、qRT-PCR、細(xì)胞侵襲和黏附實(shí)驗(yàn)、His pulldown、IP和WB、IF、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，確定自噬相關(guān)蛋白9B (autophagy-related protein 9B, ATG9B)是CRC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)MYH9是ATG9B關(guān)鍵的相互作用蛋白，ATG9B和MYH9的結(jié)合通過(guò)降低它們與E3泛素連接酶的結(jié)合來(lái)增強(qiáng)彼此的穩(wěn)定性。在CRC細(xì)胞侵襲過(guò)程中，ATG9B在MYH9的輔助下被運(yùn)送到細(xì)胞邊緣，通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)吞整合素β1和Talin-1的相互作用，加速局灶性黏附(FA)的組裝，促進(jìn)整合素β1的活化。總之，本研究強(qiáng)調(diào)了ATG9B在CRC轉(zhuǎn)移中促進(jìn)黏附灶聚集的重要作用。ATG9B和MYH9可以為預(yù)防CRC進(jìn)展提供一對(duì)潛在的治療靶點(diǎn)。

在此研究過(guò)程中，利用BeaverBeads^?IDA-Nickel（Cat# 70501）純化細(xì)菌表達(dá)His標(biāo)記的ATG9B-Cd2蛋白(氨基酸298-438 (aa298-438))，然后將ATG9B-Cd2His蛋白加入轉(zhuǎn)染MYH9-Flag293T細(xì)胞的裂解液中，通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)，利用anti-his磁珠拉出相互作用的兩個(gè)蛋白，進(jìn)行western blot檢測(cè)ATG9B和MYH9相互作用(如下圖）：

Fig. 1 MYH9 interacts with ATG9B directly.

A. LoVo and SW620 cells were lysed and subjected to immunoprecipitation with anti-ATG9B antibody or rabbit IgG using silver staining. The red boxes represents the detected bands.

B. Endogenous ATG9B and MYH9 were immunoprecipitated in SW620 cells.

C. Exogenous ATG9BHis and MYH9Flag were immunoprecipitated in 293T cells.

BeaverBeads^? IDA-Nicke/ Cobalt具有超順磁性，是專為高效、快速純化組氨酸標(biāo)簽蛋白而設(shè)計(jì)的一種新型功能化材料，用于組氨酸標(biāo)簽蛋白純化操作時(shí)，無(wú)需對(duì)粗蛋白樣品進(jìn)行高速離心，也不需要過(guò)濾操作；無(wú)需控制流速，更不需要昂貴的層析設(shè)備，通過(guò)磁性分離快速實(shí)現(xiàn)固－液、液－液分離，操作過(guò)程簡(jiǎn)單。適用于純化細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等分泌或胞內(nèi)表達(dá)的可溶性組氨酸標(biāo)簽蛋白，也可用于變性蛋白的純化。

海貍磁珠法與傳統(tǒng)柱提法流程對(duì)比